Cloning and Characterisation of the DNA Polymerase A of the Extremely Radioresistant Organism Deinococcus radiodurans

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Klonierung und Charakterisierung der DNA Polymerase A aus dem strahlenresistenten Organismus Deinococcus radiodurans
Forschungsvorhaben
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Zeitschriftenheft
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Dissertation
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Zusammenfassung

Included in this work is the cloning and basic characterisation of the DNA polymerase A from the extremely radioresistant organism Deinococcus radiodurans.
According to sequence alignments and identities to Taq polymerase and DNA polymerase I from E.coli the shortened gene of polA (polA*) analog to Klentaq-1 was cloned and expressed in E. coli. A protocol for expression and purification from the t-RNA supplemented strain E. coli BL21 DE3 RIL* was established.
The purified polA* enzyme was tested successfully for polymerase activity. Experiments showed that polA* is not thermostable, although the tight relations of the Deinococcacae to the Thermus family.
It was published that D. radiodurans accumulates actively manganese ions intracellular during radiation and DNA damaging events, but the comprehensive meaning of this is still not fully understood. Experiments were conducted to show if polA* is active only with Mg2+ or also with additional manganese ions. The results showed that Mn2+ up to 1 mM can increase the enzyme activity, higher concentrations will inhibit polA*.
In a next set of experiments the template dependence of polA* was tested. A DNA primer-template system, an RNA system and a DNA-RNA mixed system were tested for either NTP or dNTP incorporation. Because only DNA primer-template elongation with dNTPs could be detected in quantitative yields, polA* is a DNA-dependent DNA polymerase.
For further characterisation the selectivity of nucleotide incorporation by polA* was tested. Qualitative experiments with all possible combinations of template and incorporated nucleotide were conducted. It was observed that under conditions with low enzyme concentrations polA* only inserts the matching nucleotide. This high selectivity can be modified by addition of manganese ions. To be able to compare these data for polA* with other polymerases steady-state kinetic were measured for all reactions with and without 1 mM Mn2+.
It was shown that polA* is involved in DNA repair mechanisms of D. radiodurans. That is why the next set of experiments should show the ability of polA* for DNA lesion bypass. Modifications like an abasic site, oxoAdenine and oxoGuanine were intruduced to template strands, which were incubated with either a primer for running start conditions or standing start conditions. In primer extension experiments was observed that the incorporation stops prior to the lesion on the template strand. Higher enzyme concentrations and 1 mM Mn2+ enabled further synthesis - a nucleotide was incorporated opposite to the lesion. In case of the oxo-modifications also full-lenghth elongation could be detected. Next the single nucleotide incorporation opposite to the lesions was examined. The results showed that polA* incorporates mainly dATP opposite to the abasic site and the matching nucleotide opposite to oxo-modified bases. Again steady-state kinetics were conducted for all nucleotide combinations and with and without manganese ions.
The wildtype enzyme of polA consists of a polymerase domain and a 5´-3´exonuclease. The latter is used to remove 5´overhangs from DNA double strains. This can be done by removing the flap directly at the beginning of the new strand or by strand displacement synthesis. To test whether polA* is able to displace an already existing DNA strand during synthesis, a primer-template system was developed which contains a single-stranded gap between two double-stranded parts. It could be shown that polA* can displace the strand with higher enzyme concentrations. Modification of the results by addition of manganese ions could not be observed.
To gain further insights into the action of polA, a crystal structure of the protein would be neccessary. Beside this experiments with purified and partially purified components of already known repair pathways of D. radiodurans could give more details of the involvement and action of polA.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die DNA Polymerase A aus dem strahlenresistenten Bakterium Deinococcus radiodurans kloniert und näher charakterisiert.
Entsprechend der Sequenzidentitäten und Vergleiche zu Taq Polymerase und DNA Polymerase I aus E.coli, wurde das verkürzte polA-Gen (polA*) analog zu Klentaq-1 in einen Vektor kloniert und in E. coli exprimiert. Es wurde ein Protokoll für Expression und Aufreinigung aus dem Triplett-sublementierten Stamm E. coli BL21 DE3 RIL+ entwickelt.
Das aufgereinigte Enzym wurde erfolgreich auf Polymeraseaktivität getestet. Es konnte mit Hilfe verschiedener Versuchsansätze festgestellt werden, dass die polA* keine thermostabile Polymerase ist, obwohl die Deinococcacae sehr eng mit der Thermus Familie verwandt sind.
Aus Untersuchungen zum Verhalten des Bakteriums D. radiodurans während Strahleneinwirkung und den folgenden DNA Reaparaturmechanismen weiss man, dass dieser aktiv intrazellulär hohe Konzentrationen an Manganionen akkumuliert, deren umfassende Bedeutung noch nicht komplett geklärt ist. Aufgrund dessen, wurde getestet, ob polA* nur mit Magnesiumionen oder auch mit Manganionen Polymeraseaktivität entfalten kann. Die Versuchsergebnisse ergaben, dass polA* mit bis zu 1 mM Mn2+ (zusätzlich zu Mg2+) in seiner Aktivität gesteigert werden kann.
Als weiteres wurde untersucht, ob polA* sowohl DNA als auch RNA Primer-Templat -Systeme akzeptieren und neue Nukleotide entsprechend anfügen kann. Es zeigte sich, dass polA* eine DNA-abhängige DNA Polymerase ist.
Im nächsten Schritt der Charakterisierung wurde die Selektivität des Nukleotideinbaus näher betrachtet. Anhand qualitativer Experimente konnte gezeigt werden, dass polA* eine sehr genaue Polymerase ist, d.h. nur das kanonische Nukleotid eingebaut wird. Diese Genauigkeit kann durch Zugabe von Manganionen reduziert werden. Um diese Daten besser untereinander und mit anderen Polymerasen vergleichen zu können, wurden zu allen möglichen Basenkombinationen kinetische Daten unter Steady-State Bedingungen erhoben sowohl ohne Mn2+ als auch unter Einfluss von 1 mM Manganionen.
Da vermutet wird, dass polA* in DNA Reparaturmechanismen in D. radiodurans involviert ist, sollte als nächstes untersucht werden, wie polA* auf DNA-Schäden wie einer abasischen Stelle, oxo-Adenine und oxo-Guanine reagiert. Diese DNA-Modifikationen wurden jeweils in einen Templatstrang integriert und die Verlängerung eines Primers, der entweder mehrere Basen vor dem Schaden bzw. direkt am Basenpaar vor dem Schaden endet, untersucht. Es zeigte sich, dass die Synthese durch polA* vor der Modifikation abbricht. Durch Zugabe von Manganionen oder höheren Enzymkonzentrationen konnte der Einbau eines Nukleotides gegenüber dem Schaden induziert werden. Im Falle der oxo-Modifikationen von Adenine und Guanine konnte unter diesen Bedingungen sogar die komplette Verlängerung des Primers detektiert werden. Im nächsten Schritt wurde dann der Einzeleinbau gegenüber der Modifikation untersucht. Die Versuchsergebnisse ergaben, dass gegenüber der abasischen Stelle hauptsächlich ein dATP eingebaut wird und zu den oxo-modifizierten Basen das passende Nukleotid verwendet wird. Zu allen Schadens- und Nukleotidkombinationen sowohl ohne als auch mit Mn2+ wurden kinetische Steady-State Daten erhoben.
Das Wildtyp-Enzym der polA enthält neben der Polymerase-Domäne auch eine 5´-3´-Exonuclease-Funktion. Diese dient der Restriktion von 5´-Überhängen an DNA-Doppelsträngen. Diese werden meist gezielt am nächsten überlappenden Basenpaar entfernt oder es erfolgt eine weitere Synthese in den bereits bestehenden Doppelstrang hinein, wobei der vorhandene Strang verdrängt wird. Dies wird als Strand-Displacement bezeichnet. Um zu testen, ob polA* bei der Neusynthese prinzipiell zum Verdrängen eines bereits vorhandenen DNA Stranges fähig ist, wurde ein Primer-Templat-System entwickelt, welches zwischen zwei doppelsträngigen Bereichen eine einzelsträngige Lücke aufweisst. Im Experiment zeigte sich, dass polA* mit höheren Enzymkonzentrationen den vorhandenen Strang durch Neusynthese verdrängt. Bei diesen Versuchen konnte kein modifizierender Einfluss von Manganionen nachgewiesen werden.
Um weitere Einblicke in die Funktionsweise der D. radiodurans Polymerase A zu erlangen, wäre eine Kristallstruktur des Enzyms hilfreich. Desweiteren könnten Experimente mit aufgereingten Komponenten der bereits näher untersuchten Reparaturstrategien aus D. radiodurans, die Beteiligung und Funktionsweise der Polymerase A näher beleuchten.

Fachgebiet (DDC)
540 Chemie
Schlagwörter
DNA Polymerase A, Deinococcus radiodurans, DNA polymerase, DNA Repair, radioresistance
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690HEINZ, Kathrin, 2007. Cloning and Characterisation of the DNA Polymerase A of the Extremely Radioresistant Organism Deinococcus radiodurans [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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January 10, 2008
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