Ionenbindung an die Na,K-ATPase

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2000
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Schneeberger, Anne
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Ion binding to the Na,K-ATPase
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Thema dieser Arbeit war die cytoplasmatische Ionenbindung an die Na,K-ATPase. Durch Verdau mit Trypsin wurde die sogenannte 19kD-Präparation mit kaum veränderter Ionenbindung hergestellt. Ein chymotryptischer Zweitverdau hatte bei weiterhin unveränderter K-Bindung eine deutlich verringerte Affinität für Na-Ionen zur Folge (gemessen mit RH 421). Daher konnte den wenigen durch Chymotrypsin abgetrennten Aminosäuren des N-Terminus der Beta-Untereinheit eine wichtige Rolle bei der Na-Bindung zugewiesen werden. Durch sehr rauscharme Messungen mit FITC und ein verfeinertes Auswertungsverfahren konnte beim Übergang E1->Na3E1 eine (Neben-) Konformationsänderung nachgewiesen werden. Vergleiche mit RH 421-Experimenten legten nahe, daß es sich um den Schritt Na2E1->Na3E1 handelt. Die Bindung des 3. Na-Ions bewirkt vermutlich eine strukturelle Umlagerung im Protein und triggert so die Phosphorylierung durch ATP. RH 421-Messungen mit einer Reihe ein- bis 3-wertiger Kationen und Na-Analoga zeigten, daß alle eingesetzten Ionen zwar mit Na kompetierten, aber keines elektrogen an die neutrale Bindestelle binden konnte. Daher binden diese Ionen wohl an die beiden geladenen Ionenbindungsstellen. Vergleiche zwischen den Affinitäten der Pumpe für verschiedene einwertige Kationen lassen den Schluß zu, daß die Bindungstasche für das die Affinität bestimmende Ion einen Durchmesser von etwa 3 A hat. Es wurden mathematische Modelle zur Kompetition zwischen den Ionen aufgestellt und Fitprogramme zur Bestimmung der Na-Affinitäten entwickelt. Die damit durchgeführten Simulationen ergaben, daß K2 die apparente Affinität bestimmt und daß K3 kleiner als K2 ist. Letzteres ist ein Hinweis darauf, daß die 3. Na-Bindestelle erst nach der Besetzung der ersten beiden erscheint. Die Form der Na-Titrationskurven legte die Forderung nach gemischten Bindungszuständen nahe. Ein Modell, das dieser Forderung Rechnung trägt, wurde aufgestellt.
Summary in another language
In this thesis ion binding to the cytoplasmic sites of the Na,K-ATPase was investigated. Proteolysis by Trypsin yielded the so-called 19-kD preparation with only slightly altered ion binding properties. Redigestion with Chymotrypsin lead to a substantially reduced affinity for Na ions (as measured by RH421), leaving the K binding again unaffected. Thus an important role in Na binding could be assigned to the few amino acids of the N terminus of the beta subunit that had been removed by the chymotryptic digestion. Low-noise measurements with FITC together with a refined method of data analysis allowed to prove that the transition E1->Na3E1 is accompanied by a minor conformational change. A comparison with RH421 experiments suggested that the crucial step is Na2E1->Na3E1. The binding of the third Na ion probably leads to a structural rearrangement in the protein and thus triggers the phosphorylation by ATP. RH421 measurements with a variety of mono- to trivalent cations and Na analoga showed that all ions tested competed with Na, but none were able to electrogenically bind to the neutral binding site. Thus these ions are supposed to bind to the two charged ion binding sites. A comparison between the affinities for various monovalent cations of the pump allowed to estimate the diameter of the binding pocket of the ion that determines the apparent affinity to be about 3 A. Mathematical models were constructed to describe the competition between the various ions tested and fitting programs were developed to determine the affinities for Na of the pump. Simulations carried out by means of the above-mentionend programs showed that K2 determines the apparent affinity for Na and K3 is smaller than K2. The latter indicates that the third binding site is accessible only after the first two sites were filled. The form of the Na-titration curves suggested the existence of mixed binding states. A new model that accounts for those was developed.
Subject (DDC)
570 Biosciences, Biology
Keywords
Na,K-ATPase,cytoplasmatische Ionenbindung,Energie-Transport-Kopplung,Gleichgewichtskonstante,mathematisches Modell,Sodium pump,cytoplasmic ion binding,electrochromic fluorescent dye,energy transduction mechanism,equilibrium dissociation constant
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ISO 690SCHNEEBERGER, Anne, 2000. Ionenbindung an die Na,K-ATPase [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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