Human Mps1 Kinase is required for the Mitotic Spindle Checkpoint, but not for Centrosome Duplication

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2003
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Stucke, Volker Matthias
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Die humane Proteinkinase Mps1 ist essentiell für den mitotischen Spindelkontrollpunkt, aber nicht für Zentrosomenduplikation
Publikationstyp
Dissertation
Publikationsstatus
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Zusammenfassung

Die Familie der Mps1-Proteinkinasen (Monopolar spindle 1) hat mehrere wichtige Aufgaben im Zellzyklus. Mps1p wurde zuerst in S. cerevisiae gefunden und näher charakterisiert. Mps1p ist zum einen an der Verdoppelung des Spindel-Polkörperchens beteiligt und zum anderen ist die Kinase eine Komponente im mitotischen Spindelkontrollpunkt. Das Spindel-Polkörperchen ist das Centrosomäquivalent in Hefezellen und somit das Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) in Zellen. Zu Beginn der Mitose dient das MTOC zum Aufbau des mitotischen Spindelapparates, der aus Mikrotubuli besteht. Mikrotubuli zeigen in dieser Phase eine hohe Dynamik, was durch Hinzufügen und Entfernen der sie aufbauenden Einzelbausteine, der Tubuline, erklärt werden kann. Während des Zellzyklus muss sich das Spindel-Polkörperchen/Centrosom verdoppeln, um zu Beginn der Mitose eine bipolare Spindel aufbauen zu können. Hefemutanten im MPS1-Gen bilden dagegen eine monopolare Spindel, was auf einem Defekt während der Verdoppelung des Spindel-Polkörperchens beruht. Die Untersuchung der MPS1-Mutanten liess aber auch die zweite, bedeutende Funktion von Mps1p im Zellzyklus erkennen: die Kinase spielt im mitotischen Spindelkontrollpunkt eine wichtige Rolle. Dieser Kontrollpunkt gewährleistet, dass es während dem Übergang von der Metaphase zur Anaphase zu einer gleichmässigen Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen kommt. Beim Eintritt in die Mitose binden die Mikrotubuli des mitotischen Spindelapparates an die replizierten Chromosomen, auch Schwesterchromatiden genannt. Die Bindestellen der Mikrotubuli auf den Schwesterchromatiden werden als Kinetochoren bezeichnet. Dabei handelt es sich um spezifische Proteinkomplexe an den Centromeren von Chromosomen, die die Mikrotubuli einfangen und stabilisieren. Der mitotische Spindelkontrollpunkt verzögert nun die Trennung der Schwesternchromatiden solange bis alle Kinetochoren an Mikrotubuli gebunden sind. Komponenten des mitotischen Spindelkontrollpunkts lokalisieren an Kinetochoren, um den Zustand der Mikrotubulibindung zu überprüfen. Erst wenn alle Kinetochoren mit Mikrotubuli verbunden sind, wird das inhibitorische Zellzyklussignal ausgeschaltet, und die Zelle kann mit der Mitose fortfahren. In diversen Organismen wurden Proteinkinasen identifizert, die Homologie zu Mps1p von S. cerevisiae aufweisen. Für S. pombe und X. laevis wurde eine Funktion der Mps1 Proteinkinase im mitotischen Spindelkontrollpunkt gezeigt. Demgegenüber steht eine Studie in M. musculus, in der mMps1 für die Duplikation der Centrosomen notwendig ist. Wir haben eine detailierte Untersuchung über die Funktion der humanen Mps1 Proteinkinase durchgeführt. Wir zeigen, dass hMps1 im Verlauf des Zellzyklus reguliert wird. Proteinexpression und Kinaseaktivität sind während der Mitose am höchsten. Wird zusätzlich der mitotische Spindelkontrollpunkt induziert ist hMps1 maximal phosphoryliert und aktiviert. Mehrere, hochspezifische monoklonale Antikörper gegen hMps1 zeigen, dass das Protein in frühen Phasen der Mitose an den Kinetochoren lokalisiert, wofür die amino-terminale, regulatorische Domäne von hMps1 notwendig ist. Wir finden keine Lokalisierung von hMps1 an Centrosomen in Interphase und auch nicht an den Spindelpolen während der Mitose. Zudem geben mehrere funktionelle Analysen wie die Überexpression von Wild-typ- und katalytisch inaktiver Mutanten, Antikörpermikroinjektionen und siRNA-Experimente keine Hinweise auf eine Funktion von hMps1 in der Duplikation der Centrosomen. Demgegenüber wird aber durch Antikörpermikroinjektionsstudien und siRNA-Experimente gezeigt, dass hMps1 eine essentielle Funktion in der Etablierung und / oder in der Aufrechterhaltung eines aktiven mitotischen Spindelkontrollpunktes in humanen Zellen hat. Wird die Funktion von hMps1 ausgeschaltet, können die Zellen sowohl nicht mehr den Spindelkontrollpunkt aktivieren als auch nicht mehr imZellzyklus in der frühen Mitose arretieren. Schliesslich wird noch der Mechanismus untersucht, wie hMps1 im Spindelkontrollpunkt funktioniert. Wir zeigen, dass hMps1 wichtig ist für die Kinetochorlokalisierung von spezifischen Spindelkontrollpunktproteinen. hMps1 ist einerseits notwendig für die Bindung von hMad1/hMad2-Proteinkomplexen an Kinetochoren, während andererseits die Lokalisierung von Spindelkontrollpunktproteinen wie hBub1/hBubR1 und CENP-E nicht von hMps1 abhängen. Das Protein Hec1 dagegen ist entscheidend dafür, dass hMps1 effizient an das Kinetochor lokalisieren kann. Aus diesen Resultaten folgern wir dass die Funktion von hMps1 für den mitotischen Spindelkontrollpunkt gebraucht wird, aber nicht für die Duplikation der Centrosomen. Diese Schlussfolgerung steht im Widerspruch zur gegenwärtigen Annahme, dass Mps1 Proteinkinasen evolutionär konservierte duale Funktionen haben. Wir schlagen vor, dass die primäre Funktion von Mps1 Proteinkinasen im mitotischen Spindelkontrollpunkt liegt.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

The founding member of the Mps1 kinase family, Mps1p of Saccharomyces cerevisiae, has been implicated in the regulation of many cell cycle-related processes, including the duplication of the spindle pole body (SPB) (Winey et al., 1991) and the correct segregation of chromosomes during cell division (Weiss and Winey, 1996). Mutants in the MPS1 gene give rise to monopolar spindles (Winey et al., 1991; Schutz and Winey, 1998) and mps1 mutants are unable to arrest in mitosis in response to spindle damage, indicating a function in the mitotic spindle checkpoint. In this study, we have undertaken a functional analysis of the putative Mps1 homolog in human cells. This kinase originally was designated as TTK (Mills et al., 1992) or PYT (Lindberg et al., 1993), but recently has been renamed hMps1 (Fisk and Winey, 2001). We show that hMps1 is a cell cycle-regulated protein kinase, displaying maximal kinase activity during mitosis. In addition, the activity and phosphorylation state increase upon activation of the mitotic spindle checkpoint. Several monoclonal antibodies raised against hMps1 show that hMps1 localizes to kinetochores, especially during early stages of mitosis and the kinetochore-targeting domain is located within the amino-terminal, regulatory domain of hMps1. However, hMps1 is localized neither to centrosomes in interphase nor to spindle poles in mitosis. Furthermore, various functional analyses - overexpression of wild-type and kinase dead alleles, antibody microinjections, and small interfering RNA (siRNA) - did not reveal any evidence for implicating hMps1 in centrosome duplication. In contrast, microinjection of highly specific antibodies, as well as silencing of hMps1 by siRNA demonstrated that hMps1 is required for the establishment and/or maintenance of the mitotic spindle checkpoint in human cells. Finally, we explore the mechanism through which hMps1 functions in checkpoint signaling. We show that hMps1 is required for the recruitment of hMad1/hMad2 complexes to kinetochores, whereas it does not affect kinetochore-association of the protein kinases hBub1/hBubR1 and the motor protein CENP-E, indicating that hMps1 functions through a specific subset of checkpoint proteins. Furthermore, we define the kinetochore protein Hec1 as an upstream component of hMps1, which is required to localize hMps1 efficiently to kinetochores. Our results lead us to conclude that hMps1 is required for the mitotic spindle checkpoint but not for centrosome duplication. This conclusion upsets the current assumption that Mps1 kinases have evolutionarily conserved dual functions. We propose that the primary function of these kinases is related to the mitotic spindle checkpoint in all eukaryotes.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Zentrosomenduplikation, mitotischer Spindelkontrollpunkt, cell cycle, centrosome duplication, hMps1 kinase, mitosis, mitotic spindle checkpoint
Konferenz
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ISO 690STUCKE, Volker Matthias, 2003. Human Mps1 Kinase is required for the Mitotic Spindle Checkpoint, but not for Centrosome Duplication [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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July 22, 2003
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