Probing the Dynamics and Assembly Process of Molecular Machines by Structural Mass Spectrometry

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2021
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Sailer, Carolin
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In dieser kumulativen Doktorarbeit wurde die Methode der strukturellen Proteomik „chemical crosslinking coupled to mass spectrometry (XL-MS)“, also das chemische Vernetzen von Proteinen und das anschließende Auslesen und Identifizieren der verbundenen Peptide mittels Massenspektrometrie, eingesetzt und weiterentwickelt um unser Verständnis von zwei wichtigen zellulären Prozessen zu erweitern: Die molekulare Grundlage für E6-Bindung und Substraterkennung durch die E3 Ligase E6AP sowie Ribosombiogenese. Der erste dieser zellulären Prozesse ist relevant bei Gebärmutterhalskrebs, der durch humane Papillomaviren (HPV) induziert wird und involviert den E6AP-E6-p53 Proteinkomplex. In Anwesenheit des viralen Onkoproteins E6 wird die humane E3 Ubiquitinligase E6AP aktiviert und dereguliert, was dazu führt, dass der Tumorsuppressor p53 ubiquityliert wird. Im zellulären Kontext trägt der anschließende proteasomale Abbau von p53 zur Entstehung von Gebärmutterhalskrebs bei. Obwohl die HECT-Domäne von E6AP sowie ein Bindemotiv für E6 bereits kristallisiert wurden, gibt bisher keine strukturelle Studie Aufschluss darüber, wie Volllängen E6AP gegenüber E6 und p53 im E6AP-E6-p53 Proteinkomplex orientiert ist, oder wie die E3-Ligase-Aktivität von E6AP durch die Interaktion mit E6 stimuliert wird. Daher wurden in dieser Studie verschiedene Methoden der strukturellen Massenspektrometrie entwickelt und angewendet um den Effekt des E6 Onkoproteins auf die Konformation von E6AP zu untersuchen. Unter Anwendung von XL-MS auf dem Stand der Technik wurde hier eine neue Bindestelle von E6 mit der HECT-Domäne von E6AP identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass diese Bindestelle auch im E6AP-E6-p53 Enzym-Substrat-Komplex mit allen drei Proteinen voller Länge eine wichtige Rolle spielt. Inter-Protein-Crosslinks, die hier identifiziert wurden, zeigten, dass die Positionierung von E6 und p53 in der direkten Umgebung des katalytischen Zentrums in der HECT-Domäne von E6AP den Transfer des Ubiquitinmoleküls von E6AP auf p53 ermöglicht. Um die Homo(di)merisierung von E6AP zu untersuchen wurde darüber hinaus eine neue SILAC-XL-MS Methodik entwickelt, die den Methodenspielraum von XL-MS erweitert und jetzt erlaubt zu unterscheiden, ob zwei gecrosslinkte Peptide vom selben oder von unterschiedlichen Proteinmolekülen (Homodimer) stammen. Außerdem gab die Anwendung von quantitativem „crosslinking coupled to mass spectrometry (q-XL- 5 MS)“ Aufschluss über die strukturelle Dynamik von E6AP: in Anwesenheit von E6 traten Intra-Protein-Crosslinks zwischen N- und C-terminus von E6AP häufiger auf, als in Abwesenheit von E6. Dies lässt darauf schließen, dass der strukturelle Aktivierungsmechanismus, der durch Binding von E6 ausgelöst wird, eine Konformation begünstigt, bei der der N- und C-Terminus von E6AP in räumlicher Nähe sind. Der zweite zelluläre Vorgang, der hier untersucht wurde, beinhaltet den Aufbau des 60S Ribosoms, eines Ribonukleoprotein-Komplexes in der Größenordnung von etwa zwei Megadalton. Die Biogenese von Ribosomen erfordert einen hohen Energieaufwand der Zelle. Etwa 200 Proteine, so genannte Ribosom-Biogenese- Faktoren (RBF), sind daran beteiligt, die vorübergehend mit prä-ribosomalen Partikeln auf ihrem Weg vom Nukleolus ins Zytoplasma wechselwirken. Vollständig zusammengebaute und funktionstüchtige Ribosomen entschlüsseln im Zellplasma den genetischen Code durch das Übersetzen von „messenger RNA (mRNA)“ in Protein und spielen dadurch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Protein- Homöostase in der Zelle. Erst vor kurzer Zeit erschienen einige hochaufgelöste kryoelektronenmikroskopische (Kryo-EM) Strukturen von prä-ribosomalen 60S Partikeln, die molekulare Interaktionsstellen mehrerer RBF neu definierten und es erlaubten, Gesetzmäßigkeiten für den Aufbau des 60S Ribosoms abzuleiten. Trotzdem verbleiben viele transiente und dynamische Interaktionen, vor allem in frühen prä-ribosomalen Partikeln, bislang nicht näher beschrieben. Dies spiegelt sich in der Tatsache wider, dass für mehr als die Hälfte der bekannten 60S RBF keine strukturelle oder funktionelle Information an prä-ribosomalen Partikeln vorhanden ist, obwohl diese Proteine wichtige Rollen beim Aufbau des 60S Ribosoms spielen. In einem ersten Ansatz wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit die späte zytoplasmatische Entwicklungsphase von 60S Ribosomen untersucht. Dazu wurden Ribonukleoprotein-Komplexe der späten Vorstufen von 60S Ribosomen mittels Affinitätsreinigung am Ribosom-Biogenese-Faktor Lsg1 gewonnen und diese wurden anschließend sowohl mit XL-MS als auch mit Kryoelektronenmikroskopie (durch einen Kollaborationspartner) analysiert. In der dazugehörigen Publikation stützten und validieren identifizierte Crosslinks die Kryo-EM Strukturen und es konnten einerseits Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie das Peptidyltransferase Zentrum vervollständigt wird und andererseits konnte die präzise zeitliche 6 Reihenfolge einiger RBF festgelegt werden; zum Beispiel der Zeitpunkt der Ablösung der Assemblierungsfaktoren Arx1 und Rei1 durch Reh1. In einer zweiten, umfangreicheren Herangehensweise wurde die Gesamtheit der Assemblierungsfaktoren, die in der 60S Ribosombiogenese eine Rolle spielen, mit Hilfe von quantitativer Proteomik und XL-MS untersucht. Dazu wurden 12 RBF verwendet um frühe (nukleäre), mittlere und späte Vorstufen von 60S Ribosomen anzureichern. Die Beteiligung der großen Zahl an RBF am Aufbau des Ribosoms (~200) und die Anzahl an gecrosslinkten 60S Vorstufen (12) im Zusammenhang mit der enormen Größe und der Variabilität dieser Partikel machen diesen Datensatz zu einem der größten XL-MS Datensätze zu affinitäts-basiert angereicherten Proteinkomplexen. Im dritten Manuskript dieser kumulativen Doktorarbeit wurden die Probleme und Limitierungen betrachtet, die mit solch großen XL-MS Datensätzen einhergehen und dabei wurde ein neuer Weg gefunden, um Inter-Protein-Crosslinks in Datensätzen von mittlerem und großem Umfang zu filtern. Die Umsetzung und Anwendung des sogenannten Mono- und Intralink Filters (mi-Filter) verbesserte die Falscherkennungsrate (engl. False Discovery Rate, kurz FDR) für Inter-Protein- Crosslinks dramatisch. Dadurch konnten sowohl 22 bislang nicht modellierte als auch 2 potentiell neue Assemblierungsfaktoren an Vorstufen von ribosomalen Partikeln positioniert werden, was die Gesamtzahl an positionierten 60S Biogenese-Faktoren um mehr als 40 % erhöhte. Vor allem konnte durch diese Analyse die transiente Interaktion zahlreicher Proteine erfasst werden, darunter einige bislang uncharakterisierte DEAD-box ATPasen, die bei 60S Ribosombiogenese eine Rolle spielen. Zusätzlich ermöglichte die Analyse der quantitativen Proteomik-Daten sowohl eine detaillierte Rekonstruktion der zeitlichen Abfolge der Beteiligung von Assemblierungsfaktoren an 60S Ribosombiogenese, als auch die Identifikation von 9 potentiell neuen RBF. Paarweise Vergleiche der Korrelation der Abundanz verschiedener RBF mit sogenannten „Marker-“ RBF, die spezifisch mit einer bestimmten strukturellen Vorstufe von 60S Ribosomen wechselwirken, ermöglichte es, zeitlich aufgelöste Information zu Gewinnen. Wir zeigen mit diesem Ansatz, der quantitative und strukturelle MS Daten sowie vorhandene Kryo-EM Strukturen miteinbezieht, die neue Positionierung der DEAD-box ATPasen Dbp9 und Dbp10 sowie der Assemblierungsfaktoren Noc2 und Ecm1 an Vorstufen von ribosomalen Partikeln und geben Aufschluss über deren molekulare Funktion bei der Ribosombiogenese. Außerdem konnte mit Hilfe dieser Analyse ein umfangreiches 7 Interaktionsnetzwerk der Casein Kinase II (Ck2) während der 60S Ribosombiogenese aufgezeigt werden, obwohl diese bislang nur als Assemblierungsfaktor für 40S Ribosomen galt. Künftige strukturelle, biophysikalische und biochemische Studien an 60S Ribosombiogenese können von diesem Datensatz profitieren, da er dabei helfen kann, Eigenschaften von Kryo-EM Strukturen zu interpretieren und neue Reinigungsstrategien zu entwickeln um bestimmte Funktionen von transient assoziierten RBF an prä-ribosomalen Partikeln zu untersuchen.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690SAILER, Carolin, 2021. Probing the Dynamics and Assembly Process of Molecular Machines by Structural Mass Spectrometry [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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January 21, 2021
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Konstanz, Univ., Diss., 2021
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