Functional Characterization of the Nogo-66 Domain during Growth and Regeneration in the Fish Visual System

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2009
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Abdesselem, Houari
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Funktionscharakterisierung der Nogo-66-Domäne bei dem Wachstum und der Regeneration im Sehsystem des Fisches
Forschungsvorhaben
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Publikationstyp
Dissertation
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Zusammenfassung

The mammalian central nervous system (CNS) lacks the regenerative capacity to regrow axons upon injury. RTN-4/Nogo-A, a member of reticulon-family of proteins, is a potent myelin associated inhibitor for axon growth and regeneration in the adult CNS of higher vertebrates. In stark contrast, CNS lesioned axons in the zebrafish (ZF) optic nerve regenerate readily and re-establish functional connections with the brain. This correlates well with the absence of the inhibitory NogoA-specific N-terminal domains from the zf-rtn4/nogo (reticulon-4) gene since Nogo-A blocks axon regeneration in mammals - and also in ZF retinal ganglion cell (RGC) axons in vitro. In addition to the N-terminal NogoA-specific domains (such as NIG∆20) rat rtn-4/nogo carries a second inhibitory domain at the C-terminal, called Nogo-66, which is 67% identical with ZF-Nogo66. Therefore the main question we wanted to answer in this project was Why fish is able to regenerate its lesioned axons despite the presence of the Nogo-66 . Thus, we examined whether ZF-Nogo66 is inhibitory, like its Rat counterpart, and how it may affect ZF axon regeneration, using three classical assays. In the outgrowth assay ZF RGCs extended roughly 1.7 and 2.7 times more axons on ZF-Nogo66 than on Rat-Nogo66 and Rat-NIG∆20, respectively. In the collapse assay 79% of the growth cones elongated unimpaired by ZF-Nogo66 whereas Rat-Nogo66 and NIG∆20 caused collapse in 78 and 82% of ZF growth cones, respectively. Furthermore, in the contact assay ZF RGC growth cones showed collapse (42%) or avoidance (42%) upon contact with transfected HeLa cells expressing Rat-Nogo66 (and 63% and 20%, respectively, with Rat-NIG∆20) as GPI-anchored EGFP-fusion proteins but grew onto cells expressing ZF-Nogo66 (65%). We further analysed the expression and distribution of ZF-Nogo66 and ZF Nogo receprors (NgRs); ZF-Nogo66 was mainly located inside the oligodendrocytes, and probably not exposed on the cell surface to be in contact with regenerating axons, but Nogo-66 on myelin debris may lye in the path of regenerating (or regrowing) axons. NgR was found on the axonal surface, and may mediate the inhibitory activity of the Rat-Nogo66 in tissue culture assays. PIPLC treatment of RGC axons abolished the inhibitory effect of the Rat-Nogo66, suggesting that a GPI-anchored receptor could mediate the Rat-Nogo66 inhibition, which is probably NgR. Our results suggest, surprisingly, that ZF-Nogo66 is functionally different from the mammalian Nogo-66, it has a growth-permissive effect on ZF axons, quite in contrast to its Rat-Nogo66 homolog which inhibits axon growth. Thus, not only the NogoA-specific domain is absent in fish, but Nogo-66, the second inhibitory domain has non-inhibitory properties in fish so that ZF RTN-4/Nogo does not impair axon regeneration.
We also tried to render the permissive fish oligodendrocytes to inhibitory cells for axon growth by introducing the Rat-NIG∆20. Surprisingly, cells expressing the NIG∆20 exhibited a morphological change, they were losing their processes.
To obtain insights into the function of the zf-rtn4 gene during development, we investigated its spatio-temporal expression pattern in developing ZF embryos and larvae. Zf-rtn4 is expressed early and later during development, showing strong expression in the somites at embryonic stages, and in the brain at larval stages. RTN-4 in fish could play a role during development in neuronal and non-neuronal structures.
The present study together with earlier data imply that the fish CNS is optimized for successful neural regeneration and thus could serve as a model for the identification of parameters required for robust CNS axon regeneration in general.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Im Zentralnervensystem (ZNS) der Säugetiere können Axone nach einer Verletzung nicht regenerieren. RTN4/Nogo-A, ein Protein der Reticulon-Familie, ist ein potenter Myelin-assoziierter Inhibitor des Wachstums und der Regeneration von Axonen im adulten ZNS der meisten Vertebraten. Im Gegensatz dazu sind verletzte Axone des optischen Nerves im Zebrafisch (ZF) in der Lage zu regenerieren und neue funktionelle Verbindungen im Gehirn zu etablieren. Letzteres korreliert mit der Tatsache, dass dem zf-rtn4/nogo (reticulon-4) Gen die N-terminale NogoA-spezifische Domäne fehlt, die in Säugetieren vorhanden ist und Axonregeneration hemmt. Dies Nogo-A spezifiche Domäne inhibitiert das in vitro Wachstum von ZF retinalen Ganglienzell (RGZ) Axonen. Zusätzlich zu den N-terminalen NogoA-spezifischen Domänen, wie NIG20, enthalten alle Säugertier rtn4/nogo Gene eine zweite inhibitorische Domäne in ihrem C-Terminus, nämlich Nogo-66, was zu 67% identisch zu der entsprechenden ZF-Nogo-66 Domäne ist. Die Hauptfrage dieser Arbeit war, warum Fischaxone trotz der Anwesenheit von Nogo-66 regenerieren können. Diese Frage wurde mittels drei klassischer Assays untersucht. Das erste Experiment analysierte ob ZF-Nogo66 eine ähnliche inhibitorische Wirkung auf Axone aufweist wie Ratten-Nogo66. In einem "quantitativen Auswachsassay" wuchsen 1.7 und 2.7 mal mehr Axone auf ZF-Nogo66 als Substrat als auf Ratten-Nogo66 und Ratten-NIG20. In einem "Kollapsassay" wuchsen 79% der Wachstumskegel unbeeinträchtigt weiter wenn ZF-Nogo66 in ihre Nähe appliziert wurde, während Ratten-Nogo66 und NIG20 Kollaps von 78% und 82% der getesteten ZF Wachstumskegel hervorriefen. In einer weiteren Versuchsreihe, dem sogenannten "Kontaktassay", kollabierten ZF RGZ Wachstumskegel (42%) oder mieden den Kontakt (42%) mit Ratten-Nogo66-transfizierten HeLa Zellen. Kollaps und Vermeidung des Kontakt betrugen 63% und 20% bei Ratten-NIG20-transfizierten HeLa Zellen. Dagegen wuchsen 65% der Wachstumskegel, die in Kontakt mit ZF-Nogo66-transfizierten Zellen traten frei über deren Oberfläche. Die Peptide (Nogo-66 und NIG20) wurden für diese Versuche als GPI-verankerte, EGFP-Fusionsproteine auf der Zelloberfläche exprimiert. Zusätzlich analysierten wir das Expressionsmuster von ZF-Nogo66 und ZF-Nogo-Rezeptoren (NgRs) um entscheiden zu können, ob Nogo-66 und sein Rezeptor entlang des Weges regenerierender Axone vorhanden ist. ZF-Nogo66 wird vorwiegend im Inneren von Oligodendrozyten exprimiert und wird mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht in signifikanter Konzentration auf der Zelloberfläche präsentiert, so dass regenerierende Axone mit dem Peptid nur dann in Kontakt treten wenn es durch eine Verletzung frei wird. NgR wird auf der Axonoberfläche exprimiert, was eine Erklärung dafür liefern könnte, daß Ratten-Nogo66 auf ZF-Axone in Zellkultur inhibitorisch wirkt. Durch eine Behandlung von RGZ Axonen mit PIPLC konnte der inhibitorische Effekt von Ratten-Nogo66 aufgehoben werden, was darauf hindeutet, dass ein GPI-verankerter Rezeptor, wahrscheinlich NgR, die inhibitoriche Wirkung von Ratten-Nogo66 vermittelt.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich ZF-Nogo66 von Ratten-Nogo66 funktionell unterscheidet, indem es das Axonwachstum nicht hemmt. Somit weist insgesamt ZF RTN-4/Nogo keine inhibitorische Wirkung auf Axonregeneration auf, erstens durch das Fehlen der NogoA-spezifischen Domäne und zweitens durch Besitz einer nicht-inhibitorischen Nogo-66 Domäne.
In weiteren Versuchen wurden die sonst Axonwachstum zulassenden Fisch Oligodendrozyten durch Transfektion mit Ratten-NIG20 Peptid in inhibitorische Zellen umzuwandeln. Überraschenderweise zeigten NIG20 exprimierende Oligodendrozyten unerwartete morphologische Veränderungen in dem sie ihre Fortsätze verloren.
Um Einblick in eine mögliche Funktion des rtn4 Gens in der Entwicklung zu gewinnen, wurde in dieser Arbeit auch das Expressionsmuster von RTN4/Nogo in den frühen Entwicklungsstadien des ZF analysiert. RTN4/Nogo wird während der gesamten frühen ZF Entwicklung exprimiert, zunächst überwiegend in den Somiten und später im Gehirn, so dass RTN-4 Protein im Fisch eine Rolle in der Entwicklung spielen könnte.
Diese Studie weist zusammen mit vorherigen Daten darauf hin, dass das ZNS der Fische für erfolgreiche axonale Regeneration optimiert ist und dass man eventuell in diesem Modell die Parameter identifizieren könnte, die die Voraussetzung für eine robuste Axonregeneration im ZNS sind.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Nogo-66, Regeneration, Sehsystem und Fisch, Nogo-66, Regeneration, Visual system and Fish
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Zitieren
ISO 690ABDESSELEM, Houari, 2009. Functional Characterization of the Nogo-66 Domain during Growth and Regeneration in the Fish Visual System [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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July 27, 2009
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