Kinetic Studies on the Effect of Skp and YaeT from Escherichia coli on the Insertion and Folding of Outer Membrane Protein A into Lipid Membranes

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Kinetische Untersuchungen über den Effekt von Skp und YaeT von Escherichia Coli auf die Insertion und die Faltung von Aussenmembranprotein A in Lipid-Membranen
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Dissertation
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Zusammenfassung

Biomembranes are essential for the structural and functional integrity of the cell. Membrane proteins constitute ∼ 50% of the total mass of the outer membrane in Gram-negative bacteria, and act as ion channels, drug receptors and solute transporters. Insertion and folding of membrane proteins into membranes are not well understood, but important for membrane biogenesis and cell growth. In Gram-negative bacteria, assembly of transmembrane proteins (TMPs) into the outer membrane (OM) takes place post-translationally after their translocation across the cytoplasmic membrane in unfolded form via the SecYEG translocon. Passage of outer membrane proteins (OMPs) through the periplasm is facilitated by chaperones like the seventeen kDa protein (Skp), survival factor A (SurA) and others. A multi-protein complex composed of a transmembrane protein Omp85 (YaeT in Escherichia coli) is required for assembly of OMPs into the OM. In E.coli, this complex is formed of YaeT and at least four lipoproteins, namely YfiO, YfgL, NlpB and SmpA, of which YaeT and YfiO are the only essential components. Although investigation of insertion and folding of bacterial β-barrel membrane proteins into membranes has made progress in recent years, our knowledge about the entire process is still very limited. Many questions have arisen due to the discovery of outer membrane protein (OMP) targeting and/or assembly machinery located in the periplasm as chaperones like Skp, and in the outer membrane as Omp85 complex. The factors and principles governing targeting of OMPs and the detailed mechanism by which they assemble into the OM are still unclear. Therefore, this study was performed to systematically explore the effect of these assembly factors on insertion and folding of Outer membrane protein A, which has emerged as a model protein to examine the folding mechanism of β-barrel membrane proteins into lipid membranes.

The entire thesis work presented here is based on examining the insertion and folding of Outer membrane protein A, OmpA, from its complexes with the periplasmic chaperone, Skp into preformed lipid membranes. Role of lipid-bilayer inserted YaeT in folding of OmpA was also examined. Lastly, a method for isolation, purification and refolding of an essential lipoprotein, YfiO into lipid membranes was establishedThe major outcomes of this thesis are summarized in separate sections below.

In the first study, spontaneous folding of OmpA of E.coli from the complex with its molecular chaperone Skp into lipid membranes (SUVs), both negatively charged (DOPC/DOPE/DOPG) and neutral (DOPC) was examined as a function of pH. This study allowed investigations on principles governing targeting and assembly of chaperone-bound OMPs into the OM.
In the next study, OmpA was folded into membranes (LUVs) composed of short chain phospholipids, negatively charged DLPC/DLPE/DLPG and neutral DLPC. OmpA folding was performed from urea-denatured form, its complexes with Skp in absence, and presence of LPS.

In the third study, wild-type (wt)-YaeT, and the variant expressing its transmembrane domain (TMD-YaeT) were first purified in denatured form and then successfully refolded to their native conformations in a single step method. Next, a first in vitro assay was developed to allow further mechanistic investigations on YaeT-mediated insertion and folding of OMPs into the membrane. The effect of membrane-inserted wt-YaeT on folding of OmpA was then examined.
In the final study, initially a protocol for isolation of YfiO in pure form with high yield was established. YfiO was isolated with the lipid anchor upon solubilization either in chaotropic urea or a mild anionic detergent sarkosyl. Next, folding of YfiO was examined into detergent micelles and lipid bilayers by CD spectroscopy.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Biologische Membranen sind für die strukturelle und funktionelle Integrität jeder Zelle essentiell. Etwa 50% der gesamten Masse der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien besteht aus Membranproteinen. Diese Membranproteine sind Ionenkanäle, Rezeptoren, und Transporter für gelöste Stoffe. Der Einbau und die Faltung von Membranproteinen sind nicht gut verstanden, jedoch von großer Bedeutung für die Membranbiogenese und das Zellwachstum. In Gram-negativen Bakterien erfolgt der Einbau von Transmembranproteinen (TMPs) in die äußere Membran post-translational, nachdem die TMPs in entfalteter Form durch den SecYEG Translokationskanal der Cytoplasmamembran befördert wurden. Der Transport im Periplasma wird durch molekulare Chaperone erleichtert, z.B. durch das Siebzehn Kilodalton Protein (Skp), den Überlebensfaktor A (SurA) und andere. Ein heterooligomerer Proteinkomplex, der aus dem TMP Omp85 (YaeT in Escherichia coli), und vermutlich aus den Lipoproteinen YfiO, YfgL, NlpB, und SmpA besteht, ist für den Einbau in die Außenmembran wichtig. YaeT und YfiO sind die einzigen Proteine dieses Komplexes, die für die Zelle wirklich essentiell sind. Obwohl es bei den Nachforschungen zum Einbau und zur Faltung von β-Fass Membranproteinen in den letzten Jahren einige Fortschritte gab, so ist der Kenntnisstand immer noch sehr begrenzt. Neue Fragestellungen ergaben sich aus der Entdeckung von Proteinen, die den gezielten Einbau und den Zusammenbau der Außenmembranproteine unterstützen. Dazu gehören die Proteine des Omp85/YaeT Komplexes und auch Chaperone des Periplasmas, wie Skp. Die Faktoren und die Prinzipien, die den gezielten Einbau von Außenmembranproteinen (OMPs) unterstützen, sind noch unklar. Deshalb wurde diese Studie durchgeführt, um die Effekte der verschiedenen Faktoren, die bei der Faltung von OMPs wie Außenmembranprotein A (OmpA) bedeutend sind, systematisch zu untersuchen. Die Untersuchungen dieser Effekte wurden für OmpA durchgeführt, welches für Faltungsstudien häufig als Modellprotein eingesetzt wird.

Die gesamte Dissertationsschrift basiert auf Untersuchungen des Einbaus und der Faltung von OmpA aus seinem Komplex mit der periplasmatischen Chaperone Skp in vorpräparierte Lipid-Doppelschichten. Zusätzlich wurde untersucht, welche Rolle YaeT, welches in Lipid-Doppelschichten integriert wurde, für den Einbau und die Faltung von OmpA zukommt. Zuletzt wurde eine Reinigungsmethode für das essentielle Lipoprotein YfiO entwickelt, dass in Gegenwart von Lipid-Doppelschichten zurückgefaltet wurde. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Dissertation sind in den folgenden, separaten Abschnitten zusammengefasst.

In der ersten Studie wurde die spontane Faltung von OmpA aus E. coli aus dem Komplex mit seiner molekularen Chaperone Skp in die Lipid-Doppelschichten kleiner unilamellarer Vesikel (SUVs) untersucht. Als Lipide wurden entweder Mischungen aus Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidyl¬ethanol¬amin (DOPE) und negativ geladenem Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) in verschiedenen Verhältnissen oder aber reine neutrale DOPC Membranen verwendet. Die Faltung von OmpA wurde zudem bei verschiedenen pH-Werten untersucht.

In der nächsten Studie wurde OmpA in Membranen großer unilamellarer Vesikeln (LUVs) gefaltet, die aus kurzkettigen Phospholipiden bestanden. Die Lipid membranen waren aus Mischungen von Dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), Dilauroylphosphatidylethanolamin (DLPE) und negativ geladendem Dilauroyl¬phosphatidyl¬glycerol (DLPG) zusammengesetzt. Die OmpA Faltung wurde aus der Harnstoff-entfalteten Form des OmpA und mit OmpA aus seinem Komplex mit Skp entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart von Lipopolysaccharid (LPS) durchgeführt. Die Beobachtungen in dieser Studie wurden mit früheren Resultaten für die längerkettigen Lipide verglichen, die im vorangegangenen Abschnitt beschrieben wurden.

In der dritten Studie wurde der Wildtyp (wt) des YaeT, und Fragment des YaeT, dass seiner Transmembrandomäne entspricht (TMD-YaeT) in E. coli in Form von Einschlusskörpern überexprimiert und in entfalteter Form in 8 M Harnstoff Lösung isoliert. Beide Varianten des YaeT wurden erfolgreich unter Verdünnung des Harnstoffs in ihre native Form in einem einzigen Schritt zurückgefaltet. Als nächstes wurde ein in vitro Faltungsassay für OMPs entwickelt, um zukünftige mechanistische Studien zur Außenmembranproteinfaltung durchführen zu können. Dazu wurde der Einfluss von YaeT, das in Lipid-Doppelschichten integriert wurde, auf den Einbau von Außenmembranproteinen wie z. B. OmpA untersucht.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
chaperone, membrane protein, folding, membrane, lipid bilayer
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ISO 690PATEL, Geetika J., 2009. Kinetic Studies on the Effect of Skp and YaeT from Escherichia coli on the Insertion and Folding of Outer Membrane Protein A into Lipid Membranes [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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June 19, 2009
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