Establishment of a Novel Tool to Discover Late Mitotic Protein Functions by the Example of Kinesin Kif18A

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Datum
2022
Autor:innen
Teusel, Franziska
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Dissertation
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Zusammenfassung

The process of cell division requires a profound re-organization of all cellular components, and it is essential for successful replication of organisms that no errors occur during this process. Amongst many other factors, kinesin superfamily members function as active organizers during mitosis. These ATP-hydrolyzing motor proteins use the microtubule cytoskeleton as tracks for moving cargo or directly influence microtubule dynamics at numerous locations in the cell. These functions are essential for a functional mitotic spindle and thus successful chromosome segregation. The kinesin-8 family member Kif18A is a typical example for an important mitotic kinesin. Its absence was shown to result in pronounced chromosome oscillations and failure of chromosome alignment at the cell equator. In some cell types, this leads to mitotic arrest, which is ultimately accompanied by apoptosis or slippage. Mechanistically, the motor protein is known to have both a stabilizing but also depolymerizing effect on microtubules, the details of which remain to be clarified. Upon anaphase onset, the kinesin was shown to accumulate at the central spindle. Besides observations from other species and some small hints from human cell culture experiments, it is unknown whether the kinesin has an important function in late mitosis, and if it does, whether it is similar to the role it plays during early mitosis. A major obstacle to the discovery of a late mitotic function is the fact that many cell types get stuck in a prometaphase-like state upon depletion of Kif18A. As they almost never enter anaphase, and if they do usually in an abnormal manner, it is difficult to observe any phenotypes which could give clues for a potential function. The aim of this work therefore was to establish a tool that specifically can deplete of Kif18A at anaphase onset, thus allowing cells to properly align chromosomes beforehand. Ideally, the tool acts fast and with high reliability in many cells and thus allows a proper investigation on the role of kinesin Kif18A during mitotic exit. After we could confirm the presence of the kinesin-8 motor during mitotic exit and its localization to the central spindle midzone, we successfully established a tool to degrade Kif18A at anaphase onset. This tool, termed CycBmod, consists of the N-terminal 70 amino acids of cyclin B1, but with modifications to ensure efficient degradation without interfering with Kif18A’s function. We could show both in live-cell experiments and by immunoblotting that CycBmod-EGFP-Kif18A is reliably degraded at anaphase onset with rapid kinetics. To generalize the applicability of the tag we attached it to two other proteins with known functions during mitotic exit: the kinesin Kif4A and the kinase Aurora B. We could show that, as previously described, knockdown of Kif4A results in elongated spindles during anaphase. Expression of CycBmod-EGFP-Kif4A in cells depleted of endogenous Kif4A resulted in elongated spindles as well; however, expression of a nonfunctional variant CycBmodND-eGFP-Kif4A, which is not degraded during mitotic exit, rescued the spindle phenotype. In line with this we could show that also CycBmod-eGFP-Aurora B was degraded successfully at anaphase onset and observed phenotypes resembled those observed with knockdown or treatment with an Aurora B inhibitor. We also noticed that degradation efficiency is not identical for every substrate and may depend on subcellular localization, protein abundance or tag accessibility. However, tagging Kif18A was extremely efficient. We therefore set out to observe possible phenotypes of premature Kif18A absence during mitotic exit. We could neither find an effect on chromosome segregation speed, segregation errors, nor nuclear reassembly. Experiments aimed at quantifying central spindle microtubule integrity failed due to problems in proper signal quantifications. In conclusion, we successfully established and characterized a reliable method to study Kif18A in anaphase and could show that it has a promising applicability for other proteins involved in mitotic exit. However, despite many trials, we could not discover a phenotype that occurred in absence of Kif18A during late mitosis.

Zusammenfassung in einer weiteren Sprache

Zellteilung ist ein Prozess, der eine grundlegende Umstrukturierung aller zellulären Komponenten erfordert. Für Organismen ist es dabei außerordentlich wichtig, dass keinerlei Fehler während dieser komplexen Vorgänge passieren. Die Proteinfamilie der Kinesine leistet neben vielen anderen involvierten Faktoren einen wichtigen Beitrag. Die als Organisatoren des Mikrotubuli-Zytoskeletts fungierenden Motorproteine können durch ATP-Hydrolyse entweder Cargo entlang der Miktrotubuli transportieren oder direkt die Mikrotubuli-Dynamik an zahlreichen Orten in der Zelle beeinflussen. Sie sind damit unter anderem für eine funktionale mitotische Spindel und damit für die erfolgreiche Trennung der Schwesterchromatiden essenziell. Das der Kinesin-8 Familie zugeordnete Protein Kif18A ist ein typisches Beispiel für ein Kinesin, welches relevant für eine reibungslose Zellteilung ist. In Abwesenheit von Kif18A zeigen Zellen ausgeprägte Chromosomenoszillationen und die Anordnung der Schwesterchromatiden am Zell-Äquator misslingt. In manchen Zelltypen führt dies zu einem Anhalten der Mitose, was schlussendlich zu Apoptose oder einem unkontrollierten Austreten aus der Mitose führt. Kif18A kann auf Mikrotubuli-Plusenden sowohl einen stabilisierenden als auch einen depolymerisierenden Effekt haben, der genaue Mechanismus ist jedoch nicht im Detail bekannt. Mit Beginn der Anaphase akkumuliert Kif18A an der Zentralspindel. Abgesehen von diversen Beobachtungen aus anderen Spezies ist völlig unklar, ob Kif18A dort eine Funktion hat, und falls dem so ist, ob diese ähnlich zu der Funktion von Kif18A in der frühen Mitose oder ganz anderer Art ist. Die Tatsache, dass viele Zellen bei Depletion von Kif18A in einem Prometaphase-artigen Zustand hängen bleiben, ist ein gravierendes Hindernis bei der Untersuchung einer möglichen spätmitotischen Funktion. Die depletierten Zellen erreichen so die späte Mitose gar nicht, und falls sie es tun, in einer stark abnormalen Art und Weise. Daher ist es nahezu unmöglich, Phänotypen, welche Hinweise auf eine potenzielle Funktion geben könnten, zu beobachten. Ziel dieser Arbeit war es daher eine Methode zu entwickeln mithilfe derer es möglich ist Kif18A zeitgenau erst zu Beginn der Anaphase zu depletieren. Nachdem wir die zuvor beschriebene Lokalisation des Motorproteins im Detail bestätigen konnten, haben wir erfolgreich eine Methode etabliert, bei welcher das Protein mit Abklingen des Spindel-Checkpoints verschwindet. Die Zellen können zuvor problemlos ihre Chromosomen anordnen. Zudem konnten wir zeigen, dass die Methode sowohl eine schnelle Kinetik als auch eine sehr hohe Reproduzierbarkeit aufweist. Unser CycBmod-tag besteht aus den 70 N-terminalen Aminosäuren von Cyclin B1, allerdings mit ein paar Modifikationen, um einen effizienten Abbau zu gewährleisten, ohne dabei die Funktion von Kif18A zu beeinträchtigen. Wir konnten sowohl mit Hilfe von Lebendzellmikroskopie als auch Western Blot Analysen den raschen Abbau von CycBmod-EGFP-Kif18A nachweisen. Um die Anwendbarkeit des CycBmod-Tags zu generalisieren, wurde es an zwei weitere Proteine, welche eine genau beschriebene Funktion in der späten Mitose haben, angehängt: Das Kinesin Kif4A und die Kinase Aurora B. Wie bereits zuvor beschrieben, konnten wir zeigen, dass Knockdown von Kif4A zu elongierten Spindeln in Anaphase führt. Expression von CycBmod-EGFP-Kif4A in Zellen, die zuvor mit siRNA gegen Kif4A behandelt wurden, zeigten ebenfalls diesen Phänotyp. Expression der Variante CycBmodND-EGFP-Kif4A, welche nicht verfrüht abgebaut wird, führte unter den gleichen Umständen zu einer normalen Zellteilung. Weiterhin konnten wir zeigen, dass CycBmod-EGFP-Aurora B ebenfalls erfolgreich mit Beginn der Anaphase abgebaut wurde und beobachtete Phänotypen solchen, die bei knockdown oder Inhibitoren auftraten, glichen. Wir konnten dabei jedoch feststellen, dass die Abbaueffizienz je nach Substrat unterschiedlich ist und vermutlich von Dingen wie der subzellulären Lokalisation, der Proteinkonzentration oder der Zugänglichkeit des Tags abhängt. Mit Kif18A war das Tag jedoch besonders effizient, so dass Zellen, in denen endogenes Kif18A depletiert und ektopisches CycBmod-Kif18A exprimiert wurde, auf Phänotypen nach verfrühtem Abbau von Kif18A untersucht wurden. Wir konnten allerdings weder einen Effekt auf Chromosomensegregationsgeschwindigkeit, die Häufigkeit von Segregationsfehlern oder nukleare Reassemblierung feststellen. Weitere Experimente zur Bestimmung der Mikrotubuli-Intensität and der zentralen Spindel scheiterten aufgrund von Problemen mit reproduzierbarer Signalquantifizierung. In Summe haben wir erfolgreich eine gut funktionierende Methode entwickelt, um Kif18A in Anaphase zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass sie auch für andere Proteine in der späten Mitose eine vielversprechen Anwendbarkeit aufweist. Trotz zahlreicher Versuche konnten wir jedoch keinerlei Phänotypen in Abwesenheit von Kif18A beobachten.

Fachgebiet (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter
Konferenz
Rezension
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Zitieren
ISO 690TEUSEL, Franziska, 2022. Establishment of a Novel Tool to Discover Late Mitotic Protein Functions by the Example of Kinesin Kif18A [Dissertation]. Konstanz: University of Konstanz
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March 21, 2022
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