Detection and removal of surface-bound pyrogenic contaminations

Abstract

Medizinprodukte, wie z.B. Kontaktlinsen, Endoskope oder Implantate, finden weltweit ständig wachsende Anwendung. Auch wenn sie jedes Jahr Millionen von Menschenleben retten, können doch zahlreiche Schwierigkeiten auftreten. Beginnend z.B. mit einer Blaseninfektion während eines Krankenhausaufenthaltes bis hin zu Implantatabstoßung und Gewebezerstörung ist eine ganze Palette von Komplikationen möglich. Manche dieser Problematiken werden von fieber-induzierenden Substanzen (Pyrogenen) ausgelöst, die erstens nicht von den angewandten Pyrogentests erkannt werden und zweitens durch Routinesterilisation nicht ausreichend entfernt werden. Um dieser Problematik entgegenzutreten, wurden zwei neue Verfahren miteinander kombiniert und optimiert. Die Anwendung des humanen Vollblutmodells, welches die humane Fieberreaktion in vitro (im Reagenzglas) nutzt, als ein sensitives Nachweissystem, das die inflammatorische Kapazität von Oberflächen wiederspiegelt, und das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma als eine effiziente ungefährliche Sterilisationsmethode, wurden miteinander kombiniert.Es ist uns gelungen, einen Metallblock zu entwickeln, in den verschiedene Materialien als Platten eingelegt werden können, um die humane Vollblutinkubation mit anschließender Zytokinbestimmung (Interleukin-1-beta), inklusive Positiv- und Negativkontrollen, direkt auf der Oberfläche desselben Prüfkörpers durchzuführen.Der in vitro Pyrogentest für Oberflächen war in der Lage, auf verschiedenen Materialien getrocknete Pyrogenverunreinigungen mit einer Sensitivität von 10 pg/ml im Falle von Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen. Die Verwendung von gefrierkonserviertem Blut wurde untersucht und erzielte sogar eine niedrigere Nachweisgrenze.Verschiede immun-stimulierende Substanzen wie Lipid A, der LPS-Anker, Lipoteichonsäure (LTA) von zwei verschieden Bakterienstämmen und in zwei verschiedenen Arten präpariert, Peptidoglykan (PGN) von drei verschiedenen Bakterienstämmen (zwei Gram-positive und ein Gram-negativer), Zymosan und Kombinationen von ihnen wurden eingesetzt und alle konnten konzentrationsabhängig nachgewiesen werden.Auch manuelle Verunreinigungen, die wahrscheinlichste Situation im Herstellungsprozess eines Medizinprodukts, wurden untersucht und erzielten hohe Zytokinsignale. Verschiedene Reinigungs- und Sterilisationsmethoden wie Waschen, Bürsten, Autoklavieren und trockene Hitze wurden eingesetzt, aber keine ausreichende Verringerung der gemessenen Bioaktivität wurde festgestellt.Die Verwendung des Niederdruck-Mikrowellen-Entladungs-Plasmas ist eine neue Sterilisationsmethode, die eine Abnahme der Bioaktivität von LPS um zwei Zehnerpotenzen erzielt. Auf der Suche nach dem ausschlaggebenden Depyrogenisierungsreagenz und möglichen Nebeneffekten konnten folgende Ergebnisse geschlussfolgert werden: Die beobachtete Abnahme wird verursacht durch ein Plasma-Pyrogen-Zusammenspiel. Erhöhte Temperatur, Mikrowellenstrahlung und Niederdruckbedingungen spielen dabei keine Schlüsselrolle. Weder ultraviolette Strahlung noch geladene Teilchen beeinflussen die Bioaktivitätsabnahme. Unter unseren experimentellen Bedingungen ist das Vorhandensein von atomarem Wasserstoff das depyrogenisierende Wirkprinzip. Der LPS-Inaktivierungsverlauf ist eine nicht-lineare Funktion der Zeit mit mindestens zwei Phasen, die in ihrer Beseitigungseffizienz signifikant unterschiedlich sind.Zusammenfassung der Vorteile der zwei kombinierten Systeme:Der Pyrogentest für Oberflächenist quantitativ, sensitiv und bietet umfangreiche Anwendungsmöglichkeitenist einfach, robust und praktischbasiert auf der humanen FieberreaktionDie Nachweisbarkeit eines breiten Pyrogenspektrums ist garantiertKeine Tierversuche sind beteiligtDas Niederdruck-Mikrowellen-Plasmaarbeitet schnell und effizientNiedrige Temperatur wird verwendetPreiswertOhne giftige ZusätzeKeine Sicherheitsrisiken für Personal oder UmweltDas neue Testsystem erlaubt eine immunologische Qualitätskontrolle durch einen einfachen, standardisierten Test während des Herstellungsprozesses und vor der Implantierung, um eine Pyrogenkontamination auszuschließen. Eine adäquate Möglichkeit wird damit geboten, um zu kontrollieren, ob verschiedene Materialien immunologisch inaktiv, ausreichend depyrogenisiert oder gesäubert sind.Wir stellten fest, daß das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma eine geeignete Methode ist, um immunaktivierende Verunreinigungen sehr schnell und effizient unter preiswerten und Niedrigtemperatur-Bedingungen, ohne mit dem zugrundeliegenden Substrat zu interagieren und ohne Verwendung von giftigen Zusätze zu entfernen.Daher ist die Basis für eine neue Dimension des Verbraucherschutzes gelegt, auch wenn die schlussendlichen Bedingungen für manche Verbindungen noch optimiert werden müssen.